奥维森科技：通过转录组研究不同高温下黑麦草的基因表达及耐高温基因的筛选

　　高温会对植物造成损害，其严重程度与植物的耐热性水平有关。耐热性有两个组成部分，每个组成部分都有不同的遗传基础：基础耐热性，这是对热环境适应的结果；获得性耐热性，是经过耐热锻炼后自身通过一系列生理适应后获得的耐热能力。

　　在本研究中，我们旨在通过转录组分析，在全基因组水平上全面研究两种不同高温条件下黑麦草的基因表达变化。另一方面，我们使用酵母系统来识别可能提高黑麦草耐高温性的潜在候选基因。研究结果不仅解释了黑麦草对热胁迫的反应机制，也为未来的黑麦草育种提供了理论依据。

　　实验设计：对于获得性耐热性（AT）分析，35天龄的植物以3℃/24小时的速率从20-25℃的昼夜温度转移到35-40℃，每24小时收获一次叶片。对于基础耐热性（BT）分析，39天龄的植株在35-40℃下培养24小时，在0、1、3、6、12和24小时收获叶片。在温度循环达到35-40℃后6天，对长有绿叶的黑麦草进行计数。

　　为了研究高温对黑麦草的影响，我们进行了AT和BT两个高温实验。在AT和BT条件下，黑麦草生长发育迟缓，枯萎发黄(图1A)。AT实验中的黑麦草植株表现出比BT实验具有更高的“保持绿色”比率。在AT和BT实验中，我们选择6个时间点采集黑麦草叶片材料进行EL、O2 -、H2O2含量、Fv/Fm值测定和转录组分析(图1B)。AT实验中，在35-40℃(AT_40℃)条件下，EL、O2 -、H2O2含量在暴露24 h后显著升高，而在此时间点之前变化不明显。BT试验中，EL和O2 -含量从12h (BT_12h)开始显著增加，H2O2含量从24h (BT_24h)开始显著增加。

　　利用转录组测序技术鉴定了黑麦草叶片上的差异表达基因。其中差异基因数目如图2A、2B所示。关注3个cluster，其中cluster 1中的基因表达呈下降趋势，而cluster 2中的基因呈上升趋势。与cluster 2相比，cluster 3中的基因表达在37℃时最高，在40℃时下降。

　　在BT实验中，同样关注三个cluster，cluster 1中的基因表现出基因表达下降的模式，而cluster 2中的基因则表现出相反的趋势。40℃持续3小时或6小时，cluster 3中的基因表达迅速增加，然后下降。

　　BT实验中cluster 1中的基因显示出与AT实验中cluster1中的基因相似的GO富集分析结果，这些基因在 “光合作用”中显著富集，而持续上调的DEGs（cluster 2）在“核糖体生物发生”、“转录”、“剪接体”、“DNA复制蛋白”和“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”中富集（图3E）。Cluster 3中的DEGs主要富集在“伴侣和折叠催化剂”、“折叠、分选和降解”和“内质网中的蛋白质加工”中。

　　由于在AT和BT实验中与“光合作用”显著相关的基因持续下调，我们筛选出了参与光合作用的差异基因。在BT实验中，检测到39个参与光合作用的DEGs，其中15个也在AT实验中检测到（图4A）。在AT和BT实验中，除了三个基因（KYUSg_chr2.28920、KYUSg_chro3.33989和KYUSg_hr4.3302）外，大多数基因的表达都随着温度或处理时间的增加而减少。尽管AT和BT实验都抑制了大多数光合作用相关基因的表达，但就DEGs的数量而言，AT实验对光合作用的影响比BT更为温和。

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　　热应激会引发蛋白质错误折叠、内质网应激和细胞死亡。因此，内质网在植物热应激反应中起着重要作用。在BT实验中总共检测到71个参与内质网蛋白质加工的DEGs，其中40个也在AT中检测到（图5A）。AT实验中检测到的所有40个DEGs包括一个Doa10基因（KYUSg_chr3.18318，编码E3泛素连接酶）、一个CHIP基因（KYUSg_chr7.18121，编码RING型E3泛素转移酶）和38个HSPs（热休克蛋白）。只有4个DEGs呈下降趋势。实验在AT实验中进行；对于其余36个DEGs，它们中的大多数在37℃或40℃时具有最高的表达水平（图5B）。

　　值得注意的是，尽管参与光合作用的基因的表达在25-34℃时没有显著变化，但参与蛋白质折叠的基因的表现与25-34℃的温度有更强的相关性。这些结果表明，参与蛋白质折叠的基因比参与光合作用的基因对温度更敏感。

　　选择四个具有不同表达模式的DEGs进行RT-qPCR，以验证我们转录组数据的结果。使用RT-qPCR测定的这些DEGs的变化与RNA-seq检测的相似（图6）。RT-qPCR和RNA-seq之间的相关系数（R2）在0.631-0.997之间，表明转录组数据是可靠的。

　　将热处理的黑麦草叶片（AT和BT）的RNA混合，用于构建cDNA文库。从文库中随机选择总共24个克隆来确定插入长度。在23个克隆中成功检测到插入，插入的大小在500-2000bp之间（图7A）。这些结果表明cDNA文库已经成功构建。将cDNA文库和空的pYES2转化到酵母（BY4741）中，并在不同温度下培养。结果表明，对照组（空pYES2）在39℃下不能生长。相反，实验组（cDNA文库）可以，因此我们选择39℃作为文库筛选条件（图7B）。

　　随机选择25个独立克隆，观察其在高温下的生长情况。这25个无性系可以在39℃下生长。相反，阴性对照未能生长，这表明在39℃下筛选的酵母克隆比阴性对照酵母具有更大的耐高温性（图7C）。

　　从热应激文库鉴定出124个基因，代表潜在的热应激反应基因。在转录组分析中，这124个基因中有一半是DEGs。在热胁迫下，这些DEGs在黑麦草中表现出不同的模式（图8A）。KEGG途径富集分析表明，这些基因在能量代谢中富集（图8B）。PPI分析发现，七种核糖体相关蛋白质之间存在相互作用，这可以提高酵母的耐高温性（图8C）。这一结果表明，核糖体相关蛋白可能在酵母和黑麦草的高温反应中发挥重要作用。

　　受酵母文库筛选结果的启发，我们分析了在热胁迫下编码核糖体蛋白的基因在黑麦草中的表达模式。在AT实验中，两个核糖体DEGs（编码核糖体蛋白S1和L3）随着实验的进行呈下降趋势，其余两个（编码核糖体蛋白质L10e和S4e）分别在37℃和40℃时达到最高表达水平（图9B）。对于BT实验中的38个核糖体DEGs，24个（编码17个大亚基和7个小亚基蛋白）、9个（编码7个大亚单位和2个小亚单位蛋白）和5个DEGs（编码4个大亚单元和1个小亚单元蛋白）的表达模式分别属于BT cluster 1、2和3（图9C）。核糖体蛋白在高温胁迫下的表达不同，这表明它们可能在高温耐受中发挥不同的作用。

　　本研究首次揭示了黑麦草在高温响应过程中全基因组水平基因表达水平的持续变化。我们的研究结果表明，在AT和BT实验中，随着时间的推移，光合作用相关基因的表达水平普遍受到抑制，而内质网蛋白加工相关基因的水平主要受到诱导。酵母筛选系统的分析表明，黑麦草核糖体蛋白基因可能在高温反应中发挥重要作用。我们的研究鉴定了一些与黑麦草耐热性相关的基因和蛋白质，为了解黑麦草对热胁迫的抗性提供了新的关键线索。